Il primo nucleo fu acquistato nel 1550 da Eleonora di Toledo, moglie di Cosimo I de' Medici, dalla famiglia Pitti.
Il progetto di sistemazione del giardino fu intrapreso da Niccolò Pericoli, detto il Tribolo; dopo la sua morte nel 1555, la direzione dei lavori fu assunta da Davide Fortini e successivamente, fra il 1554 e il 1561, da Giorgio Vasari.
Anche l'Ammannati vi prestò la sua opera negli anni dal 1560 al 1583 e vi progettò il cortile che ha conservato il suo nome.
Il grande spazio detto dell'Anfiteatro, di forma semiellittica, col quale si sarebbero armonizzate le due ali del cortile progettato dall'Ammannati, fu ricavato dalla grande cava di pietra ai piedi della collina di Belvedere. Questa concezione architettonica unì in un tutto armonico il palazzo Pitti e il giardino di Boboli.
Dopo il 1574 Francesco I fece subentrare come architetto Bernardo Buontalenti, che realizzò la Grotta Grande. . La grotta deriva dalla trasformazione di un vivaio eseguito fra il 1556 e il 1560 su progetto di Giorgio Vasari.
Le nicchie ai lati dell'ingresso della grotta ospitano le statue di Bacco e Cerere di Baccio Bandinelli (1552-1556). Negli angoli si trovavano, prima della loro sostituzione con calchi in cemento, avvenuta nel 1924, i Prigioni di Michelangelo.
Nei primi anni del Seicento, ai tempi del granducato di Cosimo I (1609-1621), il giardino venne ampliato, sotto la supervisione di Gherardo Mechini e Giulio Parigi, oltre la cinta muraria eretta durante la guerra contro Siena.
La composizione del giardino ebbe come asse ideale l'ampio viale dei cipressi, che conduce al grandioso Bacino dell'Isola, realizzato tra il 1612 e il 1620.
A Giulio Parigi si deve anche la Vasca dell'Isola, uno dei luoghi più suggestivi del giardino, originariamente concepita come spazio destinato alla coltivazione di agrumi e fiori.
Al centro della vasca si trovava probabilmente una fontana di Venere, fatta sostituire nel 1636 dal granduca Ferdinando II con l'Oceano del Giambologna. Risale sempre al 1636 la collocazione nell'attuale posizione della statua dell'Abbondanza, iniziata dal Giambologna e conclusa da Pietro Tacca.
Nel Settecento la dinastia medicea si estinse e il Granducato passò agli Asburgo-Lorena.
Dopo un primo periodo di abbandono, sotto Pietro Leopoldo di Lorena (1765-1790) furono intrapresi ingenti lavori di restauro che interessarono le sculture, le architetture, gli impianti idrici e la vegetazione.
Il giardino fu anche dotato di nuovi edifici, fra i quali il Kaffeehaus (1775) e la Limonaia (1777-1778), progettati da Zanobi del Rosso, e la Palazzina della Meridiana, iniziata nel 1776 da Niccolò Gaspero Paoletti.
Una nuova fase di decadenza si ebbe durante la dominazione napoleonica (1799-1814) e in seguito al tentativo della granduchessa Elisa Baciocchi di trasformare Boboli in un giardino all'inglese, mai portato a termine.
Con la restaurazione lorenese si riportò Boboli all'aspetto formale che aveva avuto sin dalle sue origini.
Nel 1834, sotto Leopoldo II, il giardino subì la distruzione dei labirinti per l'apertura di un grande viale carrozzabile, su progetto di Pasquale Poccianti.
Durante questo secolo il giardino è stato lo scenario di celebri spettacoli all'aperto.
